导读

β-羟基丁酸（BHB）是哺乳动物在饥饿、生酮饮食或长时间运动时血浆中大量累积的酮体。在过去数十年中，酮体代谢的研究主要集中于两个层面：其一，作为替代性能源底物，在葡萄糖缺乏时，BHB 经由单羧酸转运蛋白进入肝外组织（尤其是脑和心脏），通过 BDH1、SCOT 等酶的级联反应转化为乙酰辅酶A，进入三羧酸循环氧化供能；其二，作为信号分子，BHB 可激活 G 蛋白偶联受体 HCA2，抑制组蛋白去乙酰化酶（HDAC），或通过非酶促反应介导蛋白质的 β-羟基丁酰化修饰，从而广泛影响转录、炎症、氧化应激等代谢适应过程。然而，一个长期存在的问题是：所有已知的 BHB 代谢通路均局限于其与初级能量中间产物的相互转化，BHB 是否也存在通往次级代谢产物的酶促通路，并藉此发挥更直接的生理调控功能，此前尚属空白。

近年来，生酮饮食和酮酯补充剂在减肥、代谢改善甚至神经保护等领域备受关注。然而，临床研究中关于酮症状态与食欲、体重变化的关系并不完全一致：部分研究报告酮症可显著抑制饥饿感并减少摄食，另一些研究则未观察到一致效果。这种差异提示，酮体的作用可能并非单一地依赖于 BHB 本身，而可能存在尚未被识别的下游效应分子。与此同时，代谢物作为信号分子的研究范式正在迅速拓展——从乳酸的 N-乳酰氨基酸（Lac-Phe）被发现可介导运动及二甲双胍的食欲抑制效应，到短链脂肪酸通过 GPCR 调控全身代谢，均表明“次级代谢产物”在生理调节中扮演着关键角色。

2025 年 1 月，斯坦福大学 Jonathan Z. Long 团队在 Cell 杂志发表题为 “A β-hydroxybutyrate shunt pathway generates antiobesity ketone metabolites” 的研究，正是沿着这一思路取得了突破。该团队前期已证实，CNDP2（肌肽二肽酶2）可催化乳酸与氨基酸缩合生成 Lac-Phe。基于 BHB 与乳酸的化学相似性，他们提出假设：CNDP2 是否也能以 BHB 为底物，生成相应的 N-β-羟基丁酰氨基酸（BHB-氨基酸）实验结果验证了这一假设，并进一步揭示：BHB-苯丙氨酸（BHB-Phe）可激活下丘脑及脑干的特定神经元群体，显著抑制肥胖小鼠的摄食行为并降低体重；CNDP2 敲除小鼠在酮酯补充或生酮饮食干预下不仅无法产生 BHB-氨基酸，反而表现出摄食增加和体重上升；该代谢途径及其产物在人类中高度保守，饮用酮酯后人体血浆 BHB-氨基酸水平显著升高。

这一发现不仅为理解酮症的食欲抑制效应提供了新的分子解释，更重要的是，它首次揭示了 BHB 可以通过酶促衍生化生成具有直接生理活性的信号分子，将酮体代谢、氨基酸缀合与中枢食欲调控三个研究领域串联起来，也为开发基于内源性代谢物的抗肥胖疗法开辟了全新方向。

科似海生物依托高灵敏度液质联用平台，建立了覆盖乳酰-氨基酸等多种酰基氨基酸的靶向定量检测体系，支持血清、组织、细胞等多类型样本中的绝对定量分析，可为肥胖、运动代谢及营养干预研究提供精准数据支撑。

研究结果

▊▏01.CNDP2 可直接催化 BHB 与氨基酸缩合

BHB 与乳酸在化学结构上高度相似，仅相差一个亚甲基。前期研究已证实，CNDP2（肌肽二肽酶 2）能够催化乳酸与氨基酸缩合生成 N-乳酰氨基酸（如 Lac-Phe），后者是一种运动诱导的食欲抑制代谢物。基于这一结构相似性，研究者提出假设：CNDP2 是否也能以 BHB 为底物，催化生成相应的 N-β-羟基丁酰氨基酸？

为验证这一假设，研究者在 HEK293T 细胞中过表达小鼠 CNDP2，并以 BHB 和苯丙氨酸为底物进行体外反应。结果显示，CNDP2 过表达的细胞裂解液合成 BHB-Phe 的活性较对照组升高 140 倍以上。酶动力学分析进一步表明，CNDP2 对 BHB 的亲和力（Km = 8.8 mM）甚至高于乳酸（Km = 33.4 mM），尽管最大反应速率（Vmax）略低。分子对接模型预测 BHB-Phe 与 CNDP2 活性中心的 E166、D195、H455 等残基存在相互作用，点突变实验证实，这些活性中心残基的突变同时削弱了 BHB 和乳酸的催化活性。

上述结果明确了 CNDP2 同时具备乳酸和 BHB 的双重底物特异性，BHB 可经由 CNDP2 催化进入一条此前未知的次级代谢通路。

图1 CNDP2在体外催化氨基酸BHB的乙酰化

▊▏02.BHB-氨基酸是小鼠内源性酮症诱导代谢物

在体外酶学证据的基础上，研究者进一步考察了 CNDP2 在体内的分布及其催化产物的内源性存在。通过蛋白印迹检测小鼠各组织，发现 CNDP2 在肾脏和肠道中表达最高，脑、肝脏和肌肉中表达较低。组织裂解液的体外合成实验显示，肾脏和肠道的 BHB-Phe 合成活性最强，且该活性在 CNDP2 敲除小鼠中几乎完全消失。值得注意的是，CNDP2 敲除并不影响肌肽水解活性，表明该酶在体内的底物选择性具有一定特异性。

为确认 BHB-氨基酸是否为天然存在的内源性代谢物，研究者通过有机合成功制备了 BHB-Phe、BHB-Leu、BHB-Val、BHB-Met 等化学标准品，并建立了基于多重反应监测（MRM）的靶向液质联用方法。在小鼠血浆中，检测到与标准品保留时间和碎片离子完全一致的色谱峰。进一步研究发现，饥饿 24 小时、生酮饮食 1 周或口服酮酯均可诱导血浆 BHB 水平升高 2-10 倍，同时 BHB-氨基酸水平也同步显著上升，表明这些代谢物具有酮症诱导性。

图2 CNDP2 敲除消除小鼠组织中的 BHB-氨基酸合成活性

▊▏03.CNDP2 及 HMGCL 共同调控 BHB-氨基酸水平

BHB 的生成依赖于肝脏生酮途径，其中 HMGCL 是该途径的关键酶之一。为明确上游酮体供应对 BHB-氨基酸水平的调控作用，研究者检测了肝特异性 HMGCL 敲除小鼠（Alb-Hmgcl-/-）的血浆代谢物。结果显示，这些小鼠的 BHB 水平下降约 30%，而 BHB-Met、BHB-Leu、BHB-Val 分别降低 50%-80%，BHB-Phe 无显著变化。这一结果表明，不同 BHB-氨基酸对上游酮体供应的依赖程度存在差异，可能与各氨基酸底物的组织可利用性有关。

另一方面，在 CNDP2 全身敲除小鼠中，无论采用急性酮酯灌胃还是慢性生酮饮食干预，血浆中所有检测的 BHB-氨基酸均减少 90% 以上，而 BHB 本身水平无显著改变，Lac-Phe 同样减少。这一结果明确证实：CNDP2 是体内 BHB-氨基酸合成所必需的关键酶，且该途径独立于 BHB 的初级氧化代谢。

图3 CNDP2 和 HMGCL 对 BHB-氨基酸的遗传调控

▊▏04.BHB-Phe 通过激活下丘脑神经元抑制摄食

BHB-Phe 是丰度最高的 BHB-氨基酸，且与已知的食欲抑制代谢物 Lac-Phe 结构相似。研究者因此系统评估了 BHB-Phe 对摄食和体重的调控作用。 

在饮食诱导肥胖（DIO）小鼠中，单次腹腔注射 BHB-Phe（50 mg/kg）在 1-3 小时内显著减少高脂饮食摄入量，且不影响运动量、耗氧量或二氧化碳产生量。血浆 BHB-Phe 浓度在注射后 1 小时达到峰值约 20 μM，3 小时恢复至基线。在为期 14 天的慢性给药实验中，每日一次 BHB-Phe 注射可持续抑制每日摄食量，并显著减缓体重增长，其效果与配对饮食对照组相当，表明体重下降完全由摄食减少所致。

对照实验排除了 BHB 或苯丙氨酸单独作用的可能性，也排除了 BHB-赖氨酸或二肽（Phe-Phe、Leu-Leu）的活性。值得注意的是，BHB-亮氨酸、BHB-缬氨酸、BHB-甲硫氨酸同样具有抑制摄食和降低体重的效果，提示疏水性氨基酸与 BHB 的缀合是发挥活性的关键结构特征。

在机制层面，BHB-Phe 的抑食作用不依赖 MC4R、GLP-1R 或 GFRAL 受体通路，但能显著激活下丘脑弓状核、室旁核、背内侧核以及脑干孤束核和外侧臂旁核的神经元。c-Fos 与 TRAP 双重标记显示，BHB-Phe 与 Lac-Phe 激活的神经元群体存在重叠但不完全一致，提示二者可能通过部分不同的神经环路发挥作用。

最后，在 CNDP2 敲除小鼠中，酮酯补充或生酮饮食不再产生体重降低效应，反而敲除小鼠的体重增加更多、累积摄食量更大，直接证明了内源性 BHB-氨基酸在酮症状态下参与能量平衡调控的生理必要性。

图4 BHB-Phe 慢性给药抑制 DIO 小鼠摄食和体重

▊▏05.人 CNDP2 同样生成 BHB-氨基酸且酮酯可诱导

最后，研究者评估了该代谢途径在人类中的保守性。重组人 CNDP2 同样能够以 BHB 和苯丙氨酸为底物合成 BHB-Phe，其酶动力学参数（Km ≈ 7.4 mM，Vmax = 8.6 nM/min/mg）与小鼠 CNDP2 相似。在三种人源细胞系（U937 巨噬细胞、Caco-2 肠上皮细胞、PANC-1 胰腺导管细胞）中，通过 CRISPR-Cas9 敲除 hCNDP2 后，细胞裂解液的 BHB-Phe 合成活性几乎完全消失。

在健康志愿者中，饮用酮酯 1 小时后，血浆 BHB-Phe、BHB-Leu、BHB-Val 和 BHB-Met 水平均显著升高，同时 BHB 水平升高约 10 倍，而苯丙氨酸、乳酸和 Lac-Phe 无显著变化。这一结果证实，BHB-氨基酸是人类体内真实存在且可被营养性酮症诱导的代谢物，为该途径的转化研究提供了直接依据。

图5 人血浆中 BHB-氨基酸在酮酯处理后显著升高

研究小结

本研究首次揭示了一条由 CNDP2 介导的 BHB 次级代谢通路，该通路将 BHB 与游离氨基酸酶促缩合，生成一系列 BHB-氨基酸代谢物。其中 BHB-Phe 能够通过激活下丘脑和脑干的特定神经元群体，显著抑制摄食并降低体重。遗传学证据表明，CNDP2 是该通路在小鼠和人类中必需的关键酶，其敲除完全阻断 BHB-氨基酸的生成，并消除酮症状态下的食欲抑制效应。

从机制上看，该研究提出了一种“代谢通量感应”模型：当生酮作用增强导致 BHB 水平升高时，CNDP2 阳性组织（如肠道、肾脏、免疫细胞）将 BHB 与氨基酸偶联，生成的 BHB-氨基酸进入循环并作用于中枢神经系统，从而反馈性抑制摄食。这一发现将酮体代谢、氨基酸缀合与中枢食欲调控直接联系起来，也为解释生酮饮食或外源酮酯的食欲抑制效应提供了分子层面的新机制。

值得注意的是，该团队此前报道的 Lac-Phe 对应运动/二甲双胍诱导的代谢状态，而本研究中 BHB-Phe 对应酮症状态。CNDP2 作为双重底物耐受酶，可根据代谢环境（乳酸升高或 BHB 升高）生成不同的信号分子，这一特性为针对不同代谢状态的精准干预提供了理论依据。

 科似海：精准靶向代谢组学助力 BHB-氨基酸功能研究

本研究首次揭示 CNDP2 催化生成的 BHB-氨基酸是连接酮体代谢与中枢食欲调控的关键信号分子，这类低丰度酰基氨基酸的精准定量及异构体区分对检测平台提出了极高要求。

科似海生物依托高灵敏度质谱系统，可同步检测能量代谢全景通路（包括磷酸原系统、糖酵解与 TCA 循环、嘌呤代谢、氨基酸及脂质代谢），并扩展至乳酰-氨基酸等新型代谢物的靶向定量分析。支持血清、组织、干血斑（仅需 20 μL）等多种样本类型，实现 pg/mL 级别低丰度分子的可靠检出。科似海代谢以精准检测技术，赋能肥胖、运动及营养干预研究。

【参考文献】

[1] Moya-Garzon, M. D., Wang, M., Li, V. L., et al. (2025). A β-hydroxybutyrate shunt pathway generates antiobesity ketone metabolites. Cell, 188(1), 175–186.