代谢稳态失衡是多种疾病发生发展的重要特征，正如大量临床研究和基础研究所证实的，代谢通路的失调往往伴随着特征性的代谢物变化，这些变化可作为反映机体病理生理状态的关键分子标志。代谢组学作为系统生物学的重要分支，致力于全面解析生物体系中的所有代谢物组成及其动态变化。基于液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）的现代代谢组学技术，能够精准捕捉基因组调控的终端生化表型，为理解生命过程的分子机制提供独特视角。

在代谢组学数据分析中，通路分析（Pathway Analysis）是最常用的研究方法之一。该方法最初于21世纪初为分析高通量基因表达数据而开发，后被广泛应用于代谢组学研究。然而，必须指出的是，代谢物与基因在分子特性和生物学功能上存在本质差异：代谢物具有更高的化学多样性、更快的动态变化速率以及更复杂的调控网络。这些特性使得直接套用基于基因组的通路分析方法来处理代谢组数据可能产生偏差甚至错误结论。

国际权威期刊《Nature Metabolism》近期发表的题为"Metabolites are not genes—avoiding the misuse of pathway analysis in metabolomics"的综述论文系统阐述了这一重要问题。该研究通过严谨的论证指出，传统代谢组学通路分析方法存在五个关键性缺陷：

①代谢物并不一定具备协同调控性：通路分析的核心原理是基于DEG（差异表达基因）的过度表达或表达不足来推断特定通路是否被激活或失活。重要的是，基因表达受关键转录因子的促进，且在很大程度上并行运作，这意味着多个mRNA可以通过通用转录机制同时合成，从而导致它们的基因表达水平高度相关。这种生物学上的一致性有效地提高了基于基因的通路分析的灵敏度。然而代谢物通过线性途径生成，下游代谢物的产生伴随着上游代谢物作为反应底物的消耗。代谢物的顺序转化使得代谢物水平的一致性不如基因表达水平，且调控集中于少数限速步骤，因此代谢通路上调可能仅体现在终产物而非中间代谢物。（如图1a）

②代谢物具有动态转运性：代谢物浓度可能不能反映原位代谢活动，这是因为许多代谢物可以快速运输到合成部位之外或从合成部位运输出来。如氨基酸、葡萄糖、甚至三羧酸循环代谢物等。对于这些代谢物，通路活性的增加和某些代谢物产量的提高可能会被高代谢物输出通量所掩盖。同时器官间的代谢物交换会引起外源干扰效应，外源性代谢物会掩盖原位产生的代谢物，使通路活动的解释复杂化，增加通路活性判断的难度。（图1b-c）。相比之下，使用基因信息进行通路分析通常更为直接。因为基因产物通常定位于特定组织，在那里就地执行其功能。

③代谢物非单一来源与去向：基于基因的通路分析通常能提供对特定通路更准确的见解，因为基因转录的产物（即RNA）既不会被通路内的其他基因消耗，也不会由其他基因产生。此外，普遍有效的 “一个基因，一种功能” 原则确保每个基因通常在通路中具有独特的作用。这种以基因为中心的观点能够更精确和直接地解释通路活动。然而，代谢通路并非孤立运作；不同的通路活动可以汇聚产生一种代谢物。例如，丙酮酸可以通过糖酵解或丙氨酸的转氨基作用产生。然后，它可以在厌氧条件下转化为乳酸，或转化为乙酰辅酶 A；后者也在几个通路中产生和消耗（图 1d）。当涉及多个代谢反应时，代谢物的浓度是代谢过程中参与其合成和消耗的众多基因和蛋白质的共同结果。这种复杂性使得通路分析更具挑战性。仅凭代谢物浓度变化难以准确推断特定代谢通路调控异常。

④代谢组学中生物信息数据库的局限性：代谢组学通路分析面临全面参考的通路数据库不完善、非模式生物数据匮乏、疾病代谢机制认知不足及代谢物功能持续更新的挑战。除了代谢通路，代谢物还积极参与基因调控和信号通路，而这些目前尚未整合到基于代谢组学的通路分析中。同时代谢物的组织特异性（如糖异生、酮体生成具器官特异性）常在数据分析中被忽视，这些都限制了通路分析在代谢组学中的准确性。

⑤检测技术瓶颈：许多内源性代谢物是中间代谢产物。这些中间代谢物在高效的生物合成通路中具有非常低的浓度。有些中间代谢物浓度具有广泛的动态范围，高者可跨越九个数量级。因此，尽管LC-MS/MS无疑是最强大的分析工具，非靶向检测为数百种代谢物提供了高分辨率和高通量，但实际上它在捕捉代谢物的全谱，尤其是低丰度中间产物方面仍然有限（图 1e）。即使对于在非靶向代谢组学中容易检测到的代谢物，从代谢特征中确认它们仍然是一个瓶颈。过度依赖自动数据处理而不进行彻底的人工检查可能会产生通路显著性的假阳性结果。常见的源内碎裂和其他干扰物和背景噪声都会引起错误注释。而且，目前使用的LC-MS/MS技术难以区分同分异构体，这也会影响代谢通路分析及结果的准确性。

鉴于代谢物的化学和生物学复杂性以及技术限制，许多这些挑战并非容易解决。因此，应避免将通路分析简单地应用于基于LC-MS/MS的代谢组学数据，以下是几项拟解决方案提案：

01、研究人员必须坚持严格的代谢物注释

将代谢特征视为未经适当验证的代谢物并将其纳入通路分析，可能会产生视觉上吸引人的图表，但其生物学重要性不亚于随机猜测。

02、必须谨慎对待基于代谢组学的通路分析

深入了解生物学背景，包括所分析样品的类型，是必不可少的。强烈建议与生物学专家合作，以确保结果在生物学上是合理的。

03、进行多通道靶向代谢组的实验验证

在就代谢通路的显著变化得出明确结论之前，我们强烈建议对相关代谢物利用更精准、灵敏定量的质谱进行多通道靶向代谢组的实验验证，避免产生非必要的假影响结果。再得到充分验证号，应进行生物学功能验证。例如，通过湿实验检查与失调通路相关的基因或代谢酶活性的重要性。

04、使用代谢流示踪分析

使用代谢流示踪分析来获得代谢通路的活性，为代谢流向及通量提供更直接的证据。

05、多方合作，扩展对代谢通路的理解

实验学家和生物信息学家之间通过合作，以扩展我们对代谢通路的理解。在实验方面，对各种条件下生物系统的进一步研究可以揭示代谢物的新生物学功能。在生物信息学方面，需要开发新的算法来适应代谢物的独特特性。

精准同位素代谢流分析

（Precise Isotope Tracing Analysis-PITA）：

破解代谢组学通路分析误用的技术突破口

该篇文献明确呼吁：“使用代谢流示踪分析可获取基因活性与通路失调的直接证据”。代谢流分析（Metabolic Flux Analysis, MFA）通过追踪同位素标记底物的去向，直接量化代谢通量，从而提供基因活性与通路状态的动态证据。通过测定代谢物周转速率而非静态水平浓度，有效规避循环代谢物转运干扰。同时基于同位素分布模式可精确区分同一代谢物的多源合成路径。如葡萄糖碳流可定量区分进入乳酸生成与进入TCA循环（氧化代谢）的比例，破解传统靶向代谢组学的路径模糊问题。

科似海生物 PITA 解决方案：

全场景代谢流分析服务

科似海生物提供四档PITA服务体系以代谢流分析（MFA）技术为核心，构建了多维度技术优势与差异化服务矩阵。覆盖从基础探索到精准验证的全流程，直击静态代谢组学盲区，实现基因-通路功能的动态验证。

1）PITA Core（基础核心）

示踪剂：以13C-Glucose/Glutamine为同位素示踪物质进行糖代谢以及衍生物的检测。

检测范围：糖酵解（Glycolysis）、磷酸戊糖途径（PPP）、三羧酸循环（TCA）等关键代谢通路在内的55个代谢物。

技术方案：一针进样，同时涵盖正负离子模式，实现高通量代谢物的同步检测。

应用场景：适用于常规代谢通路分析、基础细胞代谢研究或疾病代谢表型的初步筛查。

2）PITA Pro（进阶专业）

示踪剂：以13C-Glucose/Glutamine为同位素示踪物质进行检测。

检测范围：在PITA Core的55个代谢物基础上，额外鉴定≤15个目标代谢物（如特定氨基酸、核苷酸）。

技术方案：两针进样（正负离子模式分开优化）。

应用场景：适用于需要深入研究特定代谢分支或产物的场景。

3）PITA Ultra（精英旗舰）

示踪剂：除13C-Glucose/Glutamine以外的同位素示踪剂（如15N、2H标记化合物、脂肪酸等）。

检测范围：针对特殊代谢通路（如脂肪酸β-氧化、氨基酸代谢、一碳循环等）或特定目标代谢物设计检测方案。

技术方案：灵活调整检测流程，两针以内完成定制化通路追踪。

4）PITA Nano（精简高效）

示踪剂：自选同位素示踪剂。

检测范围：仅聚焦3个及以下目标代谢物，如特定产物或关键中间体。

技术方案：一针以内完成定制化通路追踪。

科似海生物全新升级的PITA代谢流检测系列，以同位素示踪技术为核心，构建“基础覆盖-深度扩展-灵活定制-高效精简”的四级解决方案，助力科研工作者在代谢机制研究中实现从宏观轮廓到微观靶点的精准解析。无论您是初探代谢网络，还是聚焦特定通路机制，均可通过模块化检测方案匹配研究需求，大幅提升实验效率与数据质量。从基础代谢表型到复杂通路机制，PITA系列为您科研助力！

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【参考文献】

1.Kil Sun Lee, Xiaoyang Su, Tao Huan. Metabolites are not genes — avoiding the misuse of pathway analysis in metabolomics[J]. nature metabolism, 2025.

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